[摘 要]：目的：通過體外檢測美寶胃腸膠囊（GIC）對胚胎小白鼠小腸器官型植塊生長的作用以探索GIC修復(fù)粘膜損傷的機理。方法：體外培養(yǎng)胚胎小白鼠小腸器官型植塊，并將所有植塊分為兩組：實驗組和對照組。結(jié)果：實驗組的小腸器官型植塊能很好地維持存活，并有大量的單個細(xì)胞、細(xì)胞克隆以及片狀粘膜組織塊長出，生長的時間長，生長狀態(tài)好；而對照組的小腸器官型植塊均很快歸于死亡。二者差異極為顯著。結(jié)論：GIC能夠維持胚胎小白鼠小腸器官型植塊的存活，并能促進細(xì)胞增殖，某種程度上維持組織的完整性，重新組合成粘膜組織，此結(jié)果可能與GIC激活上皮干細(xì)胞有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]：GIC；小腸植塊；生長

GIC Could Maintain Survival and Promote Cell Growth of Organ-Type Explants of Intestine of Mouse Embryo Xu rong-xiang,Wang Yan-ping,Fan Ran,etc。

Central laboratory, MEBO Global Group 100053

[Abstract]： Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on intestinal lesion through examining the effect of on the survival and cell growth of organ-type explants of intestinal tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of mouse intestinal tissue in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants could survive in test group. Single cells, cell clones and tissue pieces could grew out of the explants and grew long and well　in test group. Conclusion: could maintain survival of intestinal explants and promote growth of cells from intestinal explants of mouse embryo and this process may be involved in the activation of epithelial stem cells.

[Key words]： GIC; intestinal explant ;　growth

　　大量臨床實踐顯示，GIC可能也是通過激活粘膜上皮干細(xì)胞、促進組織細(xì)胞生長的機理實現(xiàn)對損傷粘膜修復(fù)的，為了證明這一觀點，我們特設(shè)計了本實驗。

　　一. 儀器、設(shè)備、材料、試劑及實驗動物

　　培養(yǎng)箱（美國Forma）、冰箱（江蘇長嶺）、倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）、超級恒溫水浴及恒溫電烤箱（重慶四達(dá)）、超凈工作臺（北京半導(dǎo)體設(shè)備二廠）、顯微成像分析系統(tǒng)（上?？迫穑?、微波爐（廣東Galanz）、微型計算機（北京沐澤）、光學(xué)顯微鏡（江蘇光學(xué)儀器廠）、各種型號注射器、12孔培養(yǎng)板（丹麥NUNC）、50ml離心管、Eppendorf離心管、微量加樣器（1000μl、200μl、20μl、10μl, 均為法國Gilson）、大小滴頭、玻璃培養(yǎng)皿（φ5cm、φ6cm）、0.22μm微孔濾膜、針頭濾器、顯微外科器械、各種眼科手術(shù)器械、有蓋三角燒瓶、有蓋小試管、針頭、GIC（美寶公司生產(chǎn)）、MEM培養(yǎng)基（美國Hyclone）、胎牛血清（杭州三利）、青霉素和鏈霉素（華北制藥）等。

　　實驗動物：昆明種胚胎小白鼠

　　二. 實驗方法：

　　1．取孕16日齡的昆明雌性小白鼠，頸椎脫臼法處死之，先置于75%乙醇中粗洗一遍（2分鐘），再置于75%乙醇中消毒5分鐘；

　　2．用眼科剪以及止血鉗先剪開雌鼠的腹部皮膚，鈍性分離至兩側(cè)，充分暴露腹壁肌肉，然后小心剪開腹壁全層，切勿傷及內(nèi)臟及小鼠胚胎；

　　3．剪開子宮，從宮腔中取出胚胎鼠，置入無菌平皿中；

　　4．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠體表洗滌兩次，每次１分鐘；

　　5．用顯微外科剪刀將胚胎鼠的腹壁剪開，再用顯微外科鑷子夾起鼠近胃端小腸（包括十二指腸和空腸），截取２cm左右；

　　6．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠小腸連續(xù)洗滌兩次，每次1分鐘；

　　7．用顯微外科剪刀將腸管縱行切開，充分暴露粘膜面；

　　8．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠小腸連續(xù)洗滌兩次，每次1分鐘；

　　9．將鼠小腸置于含雙抗（青、鏈）的MEM培養(yǎng)液中沖洗2次，每次1分鐘；

　　10．將鼠小腸剪成極小的器官型植塊，大小約1mm×1mm；

　　11．將植塊置于12孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中央，每孔5塊，間隔約2mm，布局合理，粘膜面向上，輕輕按壓每塊植塊，使其緊貼培養(yǎng)板的表面；

　　12．沿著培養(yǎng)孔的邊緣，每孔中加入約0.5ml的完全MEM培養(yǎng)液，勿使培養(yǎng)液與植塊接觸；

　　13．將培養(yǎng)板置于37，５％培養(yǎng)箱中預(yù)孵育１.5小時；

　　14．每孔加完全MEM培養(yǎng)液2ml，輕拿輕放，切勿使植塊飄起，實驗組加GIC；

　　15．實驗組和對照組同步等量換液，每次去掉原液的1/２左右, 再加入相同量的新鮮MEM培養(yǎng)液；

　　16．用倒置顯微鏡觀察植塊生長情況，用顯微成像記錄分析系統(tǒng)記錄所觀察的結(jié)果，并用計算機保存圖像。

　　三．實驗結(jié)果

　　細(xì)胞培養(yǎng)110天內(nèi)的報告結(jié)果：實驗組和對照組的腸組織植塊在培養(yǎng)之初，均能固定在培養(yǎng)孔中央，但隨著培養(yǎng)時間的推移，植塊逐漸脫離培養(yǎng)孔底部平面，游離飄浮于深層培養(yǎng)液中，懸浮的位置仍然靠近培養(yǎng)孔底部，但仍然集中于培養(yǎng)孔中央，少數(shù)位于周邊，植塊的大小和形狀幾乎沒有變化，但在培養(yǎng)的第１０天左右，組織塊就開始變得膨松，然后逐漸裂解為很小的組織塊，并最終成為肉眼不易察覺的組織塊，這時在視野中發(fā)現(xiàn)了單個細(xì)胞以及細(xì)胞克隆。在培養(yǎng)的第２０天，對照組中的細(xì)胞以及細(xì)胞克隆逐漸死亡，而實驗組細(xì)胞依舊生長良好，單個細(xì)胞越來越多，在視野中到處可見，以位于中央部位的最多，細(xì)胞圓形，細(xì)胞核清晰。細(xì)胞呈典型活細(xì)胞狀態(tài)。越向外越少，邊緣幾乎沒有，細(xì)胞克隆數(shù)也逐漸增多。每個克隆所含有的細(xì)胞個數(shù)隨著時間的推移也越來越多。上述結(jié)果說明含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基無法提供給組織塊合適而充足的營養(yǎng)，而GIC作為高級細(xì)胞培養(yǎng)基能夠提供給細(xì)胞合理而充足的營養(yǎng)，保證了組織和細(xì)胞的活性。

　　下面為培養(yǎng)過程中，實驗組和對照組的對比圖譜，可以深刻反映兩組的差別。

圖１　培養(yǎng)第24天。圖1A為對照組，圖1B為實驗組。對照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是大量單個的小腸組織細(xì)胞，但其中沒有克隆。
圖2　培養(yǎng)第30天。圖2A為對照組，圖2B為實驗組。對照組中為位于視野中央的大量小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是即將形成克隆的細(xì)胞。
圖3　培養(yǎng)第38天。圖3A為對照組，圖3B為實驗組。對照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊較為完整的小腸粘膜組織。
圖4　培養(yǎng)第42天。圖4A為對照組，圖4B為實驗組。對照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊小腸粘膜組織。

圖5　培養(yǎng)第50天。圖5A為對照組，圖5B為實驗組。對照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是兩塊小腸粘膜組織。
圖6　培養(yǎng)第85天。圖6A為對照組，圖6B為實驗組。對照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊小腸粘膜組織。
圖7　培養(yǎng)第90天。圖7A為對照組，圖7B為實驗組。對照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是大量的分散生長的小腸組織細(xì)胞。
圖8　培養(yǎng)第97天。圖8A為對照組，圖8B為實驗組。對照組中的小腸組織細(xì)胞或細(xì)胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊由細(xì)胞連接起來的片狀結(jié)構(gòu)。

　　GIC可使離體腸粘膜細(xì)胞在培養(yǎng)液中重新連接組合成粘膜組織

　　現(xiàn)在一般均采用Trowell法進行體外小腸粘膜組織的器官型培養(yǎng)，此法從人體或動物經(jīng)口腔取材，取材部位為十二指腸遠(yuǎn)端和空腸近端，將取出的粘膜（不可能是純粹的粘膜組織，應(yīng)該還包括粘膜下層、肌層等等，這與我們的做法一致），將粘膜放在金屬網(wǎng)格上，然后粘膜連同網(wǎng)格一起置于多孔培養(yǎng)板中央的孔，其它孔中置入無菌生理鹽水浸泡過的無菌紗布以便保持濕度，蓋好，置入一個密閉容器中，通95%的氧氣和5%的，37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。這是目前通用的方法。但此法有明顯的缺點，即方法較為繁瑣，取材量有限，一般每次不能多于10塊活組織，多了容易引起胃腸道出血，取材量受到限制，我們現(xiàn)在采用的方法對其進行了很大的簡化，直接從新處死的胚胎動物體內(nèi)獲得無菌小腸粘膜組織，取材過程極容易控制量，也容易控制部位，特別方便快捷。

　　由于體外培養(yǎng)目前還沒有適宜的人工合成培養(yǎng)基，現(xiàn)有的報道體外培養(yǎng)的小腸粘膜組織維持存活時間較短，不管是用RPMI-1640培養(yǎng)基（附加葡萄糖、胰島素、谷氨酰胺和胎牛血清），還是用Trowell培養(yǎng)基（附加胎牛血清），細(xì)胞均最多存活24~48小時，之后就會出現(xiàn)退化和死亡，一般很難超過48小時，培養(yǎng)基中如果不加血清，時間更短，6~12小時會退化壞死，由于植塊存活時間短，給實驗者提供的檢測時間也很短，使多項目檢測不可能，只能檢測那些用藥之后立即就出現(xiàn)的反應(yīng)，長期效應(yīng)無法觀察，使實驗受到了很大限制。而在本實驗中我們使用的含有GIC細(xì)胞高級培養(yǎng)基直接打破了現(xiàn)有培養(yǎng)基方面的限制，可以長期培養(yǎng)離體腸粘膜組織，可以長期在光鏡下直接觀察GIC對粘膜生長的影響。

　　本實驗中，GIC對腸粘膜組織的細(xì)胞保護作用也得到了明顯體現(xiàn)；對于培養(yǎng)過程中觀察到的片狀粘膜組織，之所以能存在很久時間，并且其內(nèi)的細(xì)胞生長良好，是GIC對細(xì)胞外基質(zhì)的正常代謝產(chǎn)生了影響，細(xì)胞外基質(zhì)是維系細(xì)胞相互連接的基礎(chǔ)。

　　為什么胃粘膜能夠在這種環(huán)境中長期生長呢？有兩個原因：一是GIC是營養(yǎng)豐富的細(xì)胞培養(yǎng)基及良好的細(xì)胞保護劑，另一個是腸道粘膜組織中有粘膜上皮干細(xì)胞，GIC啟動了干細(xì)胞，使干細(xì)胞得以較長時間地生長。

　　對于第一個問題的解釋：

　　GIC有效成分中含有的亞油酸是細(xì)胞必需的脂肪酸，是構(gòu)成細(xì)胞生物膜不可缺少的組分，是皮膚、粘膜及深層組織損傷后進行修復(fù)的重要材料；有效成分中含有的多種氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸以及多種脂類物質(zhì)、維生素、微量元素，為腸粘膜細(xì)胞的生長提供了豐富的營養(yǎng)；有效成分還具有抗病原微生物作用，對多種細(xì)菌、病毒、真菌、原生物都有較強的抑制作用，同時具有抗炎作用；藥物中的有效成分還可以促進細(xì)胞的能量代謝，蛋白質(zhì)及核酸合成和生物膜轉(zhuǎn)運等功能；緩慢釋放，使細(xì)胞持續(xù)得到穩(wěn)定的營養(yǎng)供應(yīng)。

　　GIC的抗氧化作用表現(xiàn)為抗自由基、穩(wěn)定細(xì)胞膜。自由基是廣泛存在于各種化學(xué)反應(yīng)中的活潑基團，倘若其產(chǎn)生過量，從而引發(fā)所謂的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，則將導(dǎo)致細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化，所產(chǎn)生的大量脂質(zhì)過氧化物會損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白質(zhì)與核酸，對細(xì)胞造成損傷。有效成分中維生素E的抗自由基功能是由于其自身結(jié)構(gòu)具有還原性，進而捕捉自由基從而阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到對機體的保護作用，而其自身則經(jīng)過維生素C和含硫氨基酸的再生而還原或轉(zhuǎn)變?yōu)轷惢衔?。大量維生素E的存在可使細(xì)胞處于流動性高、通透性嚴(yán)密的狀態(tài)。這除了可保護膜上大量的多不飽和脂肪酸不被氧化外，還與其可以保護膜蛋白的活性結(jié)構(gòu)有關(guān)。

　　對于第二個問題的解釋：

　　腸道粘膜組織中有粘膜上皮干細(xì)胞，在合適條件下能夠長期生長，GIC有能力啟動干細(xì)胞使之活化。腸道粘膜的上皮組織來源于上皮干細(xì)胞（epithelial stem cell）， 用-胸腺嘧啶脫氧核苷（-TdR）標(biāo)記放射自顯影法觀察瞬間標(biāo)記后的腸腺細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，上皮干細(xì)胞位于或靠近腸隱窩的部位。為了維持動態(tài)平衡，這些干細(xì)胞不斷轉(zhuǎn)化為短暫繁殖細(xì)胞并向中段移動，最后要么分化為具有吸收功能的刷狀緣上皮細(xì)胞，要么分化為腸道內(nèi)分泌細(xì)胞。分化后的細(xì)胞最后死亡并且從腸絨毛上脫落下來并進入腸腔，任何干細(xì)胞都具有生長繁殖的能力，它們是一群分化較低的細(xì)胞，這是干細(xì)胞與分化細(xì)胞明顯的不同，體外培養(yǎng)中最容易增殖的正常細(xì)胞是干細(xì)胞，干細(xì)胞屬于未分化細(xì)胞，盡管脫離了體內(nèi)生長的微環(huán)境，但仍然具有較強的增殖能力?？梢詳嘌杂捎贕IC具有激活表皮干細(xì)胞的能力，對粘膜干細(xì)胞也應(yīng)該有相應(yīng)的激活能力。

　　至于生長的細(xì)胞的性質(zhì)，我們認(rèn)為一定是粘膜細(xì)胞，主要原因有兩個：一是因為上皮干細(xì)胞在體外有較強的增殖功能，這已經(jīng)為許多研究結(jié)果所證實，腸壁其它細(xì)胞均不具備這種能力，本實驗所用的標(biāo)本中，除粘膜細(xì)胞外，數(shù)量最多的應(yīng)該是腸壁的平滑肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞在體外可進行有限的增殖，但不能長期增殖。本實驗完全可以排除平滑肌細(xì)胞生長的可能性，因為培養(yǎng)自始至終未曾發(fā)現(xiàn)形態(tài)呈條形或梭形、排列呈束狀的平滑肌細(xì)胞生長。再次，目前還沒有發(fā)現(xiàn)平滑肌干細(xì)胞，這也是平滑肌在體外不易長期生長的重要原因。其它細(xì)胞如粘膜下層疏松結(jié)締組織中的動脈、靜脈、淋巴管、神經(jīng)纖維和粘膜下神經(jīng)叢等組織的細(xì)胞能如此生長的可能性極小。第二個原因是優(yōu)勢生長的問題，當(dāng)某種細(xì)胞特別容易生長的時候，其它細(xì)胞的生長就會受到一定程度的抑制或者完全被抑制，本實驗中腸粘膜細(xì)胞在生長中占優(yōu)勢或絕對優(yōu)勢。

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